Découverte de petites molécules qui inhibent la protéine désordonnée, p27Kip1

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 15686 (2015) Citer cet article

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Les protéines désordonnées sont très répandues dans les systèmes biologiques, elles contrôlent une myriade de processus de signalisation et de régulation et leurs niveaux et/ou leur localisation cellulaire sont souvent altérés dans les maladies humaines. Contrairement aux protéines repliées, les protéines désordonnées, en raison de l'hétérogénéité conformationnelle et de la dynamique, ne sont pas considérées comme des cibles médicamenteuses viables. Nous avons défié ce paradigme en identifiant par criblage basé sur la RMN de petites molécules qui se lient spécifiquement, quoique faiblement, au régulateur désordonné du cycle cellulaire, p27Kip1 (p27). Deux groupes de molécules liées à des sites créés par des amas transitoires de résidus aromatiques au sein de p27. Les caractéristiques chimiques conservées au sein de ces deux groupes de petites molécules présentaient une complémentarité avec leurs sites de liaison au sein de p27, établissant des relations structure-activité pour les interactions petite molécule:protéine désordonnée. Enfin, un composé a contrecarré la fonction inhibitrice Cdk2/cycline A de p27 in vitro, fournissant une preuve de principe que de petites molécules peuvent inhiber la fonction d'une protéine désordonnée (p27) par séquestration dans une conformation incapable de se replier et de se lier à une protéine naturelle. cible réglementaire (Cdk2/cycline A).

Les protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) sont très répandues dans les cellules eucaryotes et remplissent souvent des fonctions de régulation et de signalisation1. En tant que classe structurelle, les IDP sont plus étroitement régulés que les protéines repliées de la levure à l'homme2 et, lors d'une surexpression, sont plus susceptibles de modifier le phénotype cellulaire que leurs homologues repliés3. Ainsi, le maintien de l'homéostasie normale des protéines désordonnées est essentiel pour le comportement cellulaire. Les phénotypes associés à la surexpression ou à l'hyperactivité des protéines avec des domaines repliés peuvent être contrecarrés par de petites molécules inhibitrices, par exemple, de la fonction enzymatique (par exemple, Gleevec qui inhibe BCR-Abl dans la leucémie myéloïde chronique4) ou des interactions protéine-protéine (par exemple, ABT- 263 et ABT-199 qui inhibent BCL-2 et BCL-xL dans les hémopathies malignes et lymphoïdes5,6). En revanche, les protéines désordonnées représentent des cibles difficiles pour l'inhibition par de petites molécules en raison de leurs conformations dynamiques et hétérogènes. Néanmoins, des progrès ont été réalisés. Par exemple, un inhibiteur de la phosphatase PTP1B (MSI-1436), avec des rôles connus dans le diabète, l'obésité et le cancer du sein, a récemment été montré par des tests structuraux, biochimiques et fonctionnels pour agir par un mécanisme allostérique en se liant à une région régulatrice désordonnée de l'enzyme7. De plus, une petite molécule (YK-4-279) qui se lie à l'oncoprotéine de fusion EWS-FLI1 désordonnée associée aux tumeurs de la famille des sarcomes d'Ewing a inhibé la liaison directe à l'ARN hélicase A (RHA)8, un partenaire fonctionnel d'EWS-FLI1 dans les cellules tumorales8 et altération des interactions protéiques dépendantes de RHA et de l'épissage de l'ARN9. Ces deux composés (MSI-1436 et YK-4-279) ont montré des effets sur la cible dans les tests cellulaires8,9. D'autres études ont identifié de petites molécules qui ciblent les cMyc10,11,12, l'α-synucléine13 et le peptide β-amyloïde d'Alzheimer désordonnés. Une étude informatique récente15 a montré qu'une petite molécule (10074-A4) précédemment signalée comme modulant la fonction cMyc10 se liait de différentes manières à différentes molécules cMyc au sein d'un ensemble de nombreuses conformations désordonnées, amenant les auteurs à suggérer le concept de "nuages de ligands se liant aux protéines des nuages". Dans les études discutées ci-dessus, de petites molécules qui ciblent des protéines désordonnées ont été découvertes en utilisant une variété d'approches, y compris des cribles fonctionnels, des cribles de liaison in vitro et/ou des cribles informatiques. Le criblage basé sur la résonance magnétique nucléaire (RMN) de petites molécules de faible poids moléculaire appelées fragments (examiné dans16) se liant à des cibles protéiques repliées est une méthode bien établie pour identifier les «hits» initiaux dans le processus de découverte de médicaments17,18. Cependant, le criblage de fragments basé sur la RMN n'a pas, à notre connaissance, été appliqué pour identifier de petites molécules qui se lient à une protéine cible désordonnée. Ici, nous avons utilisé le criblage basé sur la RMN pour identifier les molécules de fragments qui se lient et modulent la fonction de la protéine prototypique désordonnée, p27Kip1 (p27; également connue sous le nom de CDKN1B), un régulateur des kinases dépendantes de la cycline qui contrôlent la division cellulaire eucaryote19.

La motivation pour cibler p27 était double. Tout d'abord, les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de p27 sont bien comprises20,21,22,23, fournissant un système de modèle idéal pour étudier les petites molécules : les interactions protéines désordonnées. Deuxièmement, la capacité de moduler chimiquement la fonction de p27 serait bénéfique dans plusieurs contextes biologiques. Par exemple, p27 est phosphorylé de manière inappropriée dans le cancer du sein sur la thréonine 157, qui est associée à une localisation cytoplasmique anormale et à une régulation à la hausse de la migration cellulaire24,25,26,27. La disponibilité d'une petite molécule inhibitrice de p27 serait bénéfique pour prévenir la migration anormale des cellules cancéreuses du sein. Alternativement, dans les cellules épithéliales sensorielles et non sensorielles de l'oreille interne, p27 maintient la sortie du cycle cellulaire et la différenciation terminale28 et son inhibition a entraîné leur réentrée dans le cycle cellulaire et leur régénération pour la restauration de l'audition29,30. Alors que de petites molécules qui inhibent la transcription de p27 ont été rapportées31, nous avons développé ici des approches pour identifier les petites molécules qui se lient directement à p27 et ont le potentiel de modifier sa fonction dans les deux paramètres cellulaires discutés ci-dessus.

La cible de nos études était le domaine inhibiteur de la kinase N-terminal de p27 (p27-KID), qui se lie à et régule l'activité catalytique des complexes kinase dépendante de la cycline nucléaire (Cdk)/cycline qui contrôlent la division cellulaire eucaryote32. p27-KID, qui est très désordonné isolément20,21, adopte une conformation étendue lors de la liaison à Cdk2/cycline A (Fig. 1a) qui peut être subdivisée en trois sous-domaines fonctionnellement distincts. Le sous-domaine D1 se lie à une poche conservée sur la cycline A et bloque le recrutement du substrat33 ; le sous-domaine D2 forme des brins β intra- et inter-moléculaires (entre p27 et Cdk2) lors de la liaison à Cdk2 et insère également un tour d'hélice dans sa poche de liaison à l'ATP, inhibant l'activité kinase34 ; et le sous-domaine LH forme une hélice α qui relie les sous-domaines D1 et D2. Nous avons émis l'hypothèse que, si de petites molécules qui se lient à p27-KID pouvaient être identifiées, elles pourraient induire le polypeptide désordonné à adopter des conformations qui sont incompétentes pour la liaison aux complexes Cdk/cycline. Nous avons testé cette hypothèse en criblant une bibliothèque de fragments de molécules pour la liaison à p27-KID à l'aide de la spectroscopie RMN. Nous avons identifié deux sous-ensembles de molécules de fragments (36 au total) qui se liaient de manière différentielle faiblement mais spécifiquement à deux régions partiellement chevauchées de p27-KID. À partir de ces sous-ensembles, nous avons ensuite généré des modèles de pharmacophore qui ont permis l'identification de petites molécules supplémentaires liées à p27-KID et une clarification supplémentaire des relations structure-activité. Divers tests, y compris l'anisotropie de fluorescence, la spectroscopie RMN et un test d'activité de la kinase Cdk2, ont été utilisés pour démontrer que l'une des petites molécules identifiées a déplacé la région de liaison de la kinase de p27 de Cdk2 et partiellement restauré l'activité catalytique de Cdk2. De plus, les calculs de dynamique moléculaire ont fourni des informations sur la "structure" dynamique de la région de p27 ciblée par de petites molécules. Nos résultats donnent un aperçu de la nature des interactions entre les petites molécules et une protéine désordonnée et démontrent que de telles interactions peuvent altérer la fonction de régulation des protéines désordonnées.

Identification de deux groupes de petites molécules qui se lient spécifiquement à des régions distinctes mais se chevauchant de p27-KID désordonné.

( a ) Structure de p27-KID lié à Cdk2 / Cycline A (PDB ID 1JSU); les sous-domaines de p27-KID, y compris D1, LH, D2.1, D2.2 et D2.3, sont indiqués. (b,c) Structures chimiques de deux petites molécules, SJ572710 (SJ710) (b) et SJ572403 (SJ403) (c), qui se sont liées à p27-KID et sont respectivement membres du groupe 1 et du groupe 2 (voir le texte pour le groupe définitions). ( d, e ) Histogrammes montrant les valeurs individuelles de perturbation du déplacement chimique 1H (par analyse des spectres HSQC 2D 1H-15N "en phase") à partir des titrages des composés en (b) et (c), respectivement, en 15N-p27- ENFANT. Le seuil d'identification des interactions spécifiques avec les résidus de p27-KID a été défini comme deux écarts-types au-dessus de la moyenne des valeurs de perturbation (représentées par une ligne noire en pointillés dans le graphique). La résolution spectrale expérimentale dans la dimension 1H (2,4 Hz) est représentée par la ligne pointillée magenta. Les perturbations de déplacement chimique pour les rapports molaires de 15N-p27-KID (100 μM) aux inhibiteurs de 1:30 sont présentées. ( f, g ) Les perturbations du déplacement chimique du proton amide ont été tracées en fonction de la concentration de SJ710 ( f ) et de SJ403 ( g ), respectivement. Les isothermes de liaison de certains résidus montrent une liaison spécifique entre p27-KID et les hits de fragment. Les trajectoires des déplacements chimiques (lignes noires pleines) rapportent des constantes de dissociation globales de 4,8 ± 1,3 et 2,2 ± 0,3 mM pour les interactions de p27-KID avec SJ710 (f) et SJ403 (g), respectivement.

Nous avons utilisé les méthodes de RMN 1H WaterLOGSY35 et STD36 unidimensionnelles (1D) pour identifier les petites molécules ressemblant à des fragments37,38,39 qui se sont liées à p27-KID. Les molécules de fragments ont été sélectionnées à partir d'une bibliothèque commerciale (1 100 composés de la collection Ro3, Maybridge/Thermo Fisher Scientific) ou d'une bibliothèque interne de 1 222 composés basée sur la « règle de trois »40 et d'autres critères (voir Méthodes). Deux et sept molécules chacune ont été identifiées à partir des bibliothèques respectives pour se lier à p27-KID (appelées "hits" ; les données RMN 1D 1H représentatives sont présentées dans Suppl. Fig. 1a, b et tous les hits préliminaires sont présentés dans Suppl. Tableau 1a). Les sites de liaison pour ces composés ont été identifiés par titrage dans 15N-p27-KID et analyse des spectres bidimensionnels (2D) 1H-15N HSQC. Des perturbations de déplacement chimique significatives (CSP), qui étaient les plus importantes pour les résonances amide 1H (voir Méthodes), n'ont été observées que pour les groupes amide de résidus dans le sous-domaine D2 de p27-KID (p27-D2); huit hits ont provoqué des CSP dans une courte région avec la séquence F87YY89 [(F, phénylalanine ; et Y, tyrosine), appelée sous-région D2.3 ; Fig. 1a, d] et un hit a provoqué des CSP dans la même région ainsi que dans deux autres régions proches des résidus W60N61 et E75WQ77 [(W, tryptophane ; N, asparagine ; E, acide glutamique ; et Q, glutamine), appelées sous -domaines D2.1 et D2.2, respectivement ; Fig. 1a, e]. Nous avons nommé ces molécules Groupes 1 et 2, respectivement (Fig. 1b, c); des histogrammes représentatifs de 1H CSP sont présentés sur les Fig. 1d, e et 15N CSP sont présentés dans Suppl. Fig. 2. Les données pour toutes les autres petites molécules sont présentées dans Suppl. Fig. 3.

Nous avons analysé les molécules des groupes 1 et 2 à l'aide de la modélisation informatique et identifié des molécules de liaison p27-KID candidates supplémentaires dans les deux bibliothèques de fragments qui n'ont pas été détectées par les écrans RMN 1D d'origine. L'analyse RMN 1D et 2D de ces molécules a conduit à l'identification de 15 composés de liaison p27-D2 supplémentaires (six avec des caractéristiques de liaison de type groupe 1 et neuf avec des caractéristiques de type groupe 2 ; Suppl. Fig. 3b et Suppl. Tableau 1b) . Les CSP ont été observés à des concentrations élevées de composé, compatibles avec une liaison relativement faible à p27-D2, mais étaient spécifiques aux régions notées dans p27-D2 et rigoureusement reproductibles. Titrages RMN HSQC 2D 1H-15N "en phase" en seize points d'un groupe 1 (SJ572710, ci-après appelé SJ710) et 2 (SJ572403, ci-après appelé SJ403), respectivement, dans une concentration constante de 15N-p27-KID (100 μM), a fourni des isothermes de liaison interprétables pour des résonances spécifiques de p27-KID ; les valeurs déterminées de la constante de dissociation (Kd) étaient de 4,8 ± 1,3 et 2,2 ± 0,3 mM, respectivement (Fig. 1f, g). Les spectres RMN HSQC 2D 1H-15N superposés sont affichés à la Fig. 2.

Les occurrences de fragment montrent des interactions spécifiques avec des régions spécifiques dans le sous-domaine D2 de p27-KID.

Spectres RMN HSQC "en phase" 2D 1H-15N superposés montrant des perturbations de déplacement chimique de résidus spécifiques dans le sous-domaine D2 de p27-KID après titrage du fragment atteint SJ710 (a, groupe 1) et SJ403 (d, groupe 2). Pour chaque coup, un total de seize spectres ont été enregistrés. La concentration de 15N-p27-KID (100 μM) a été maintenue constante tout au long du titrage et la concentration de l'inhibiteur a varié de 0 (rouge) à 3 mM (bleu). Toutes les expériences ont été réalisées sur un spectromètre de 800 MHz et ont utilisé des paramètres d'acquisition qui ont fourni une résolution spectrale de 2,4 Hz et 1,7 Hz dans les dimensions 1H et 15N, respectivement. Les encarts en bas à gauche montrent des résonances pour les fragments tryptophane indole NH (s-W60, s-W76). ( b, e ) Régions étendues (boîte bleue) montrant un sous-ensemble des résidus p27-KID impliqués dans l'interaction avec SJ710 ( b ) et SJ403 ( e ), respectivement. ( c, f ) Régions étendues (boîte noire) montrant deux des résidus p27-KID qui ne présentent aucune perturbation lors de l'interaction avec SJ710 ( c ) et SJ403 ( f ), respectivement.

L'analyse du champ d'interaction moléculaire tridimensionnelle (3D)41 (voir la section Méthodes) a identifié les caractéristiques chimiques communes des deux groupes de molécules de liaison p27-D2 (Fig. 3a, b). Cette analyse a révélé des "points de champ" d'interaction autour des petites molécules qui peuvent participer favorablement aux interactions électrostatiques, de van der Waals et hydrophobes. Ces points de champ sont utilisés pour calculer la similarité moléculaire et pour aligner les molécules, même celles avec des topologies bidimensionnelles différentes, pour définir un pharmacophore commun.

Cartes de champ consensus pour les deux groupes de petites molécules liées à p27-KID.

Les points de champ bleu et rouge indiquent où les groupes électropositifs et électronégatifs sont favorisés, respectivement, dans le partenaire de liaison protéique ; les points de champ dorés indiquent les régions où les interactions hydrophobes sont favorisées ; et les points de champ jaunes indiquent les régions où des contacts van der Waals favorables sont possibles. La taille du point de champ augmente avec l'amplitude de l'énergie d'interaction favorable. Deux molécules représentatives du groupe 1 (a) et du groupe 2 (b) sont présentées alignées sur leurs cartes de champ consensus respectives.

Les molécules des groupes 1 et 2 ont deux ou trois cycles aromatiques hétérocycliques mais diffèrent significativement dans la distribution des points de champ favorables. Le groupe 1 est principalement défini par un grand noyau hydrophobe (plusieurs polygones d'or à proximité; Fig. 3a), une grande région d'interaction électropositive (deux polygones cyan à proximité) et deux points de champ électropositif (cyan) et électronégatif (rouge) plus petits. à l'extrémité opposée du noyau hydrophobe. En revanche, la carte de champ du groupe 2 (figure 3b) présentait un noyau hydrophobe plus petit par rapport au groupe 1 et deux régions de taille égale d'interaction électropositive favorable. Pour élargir la diversité de notre criblage chimique, nous avons utilisé les cartes de terrain consensuelles pour les molécules des groupes 1 et 2 afin d'identifier 184 molécules de liaison p27-D2 supplémentaires possibles dans une bibliothèque de 10 455 molécules de type fragment disponibles dans le commerce. L'analyse RMN 1D et 2D de ceux-ci a identifié 12 composés de liaison p27-D2 supplémentaires (8 avec des caractéristiques de liaison de type groupe 1 et 4 avec des caractéristiques de type groupe 2; Suppl. Fig. 3c et Suppl. Tableau 1c). Ces molécules supplémentaires avaient des profils CSP comparables aux hits précédemment identifiés. Pour tester davantage la spécificité des petites molécules : interactions protéines désordonnées, nous avons déterminé si les acides aminés simples tryptophane et tyrosine se liaient à p27-KID. Cependant, même lorsqu'ils sont titrés à un excès molaire de 30 fois, aucun des acides aminés aromatiques ne provoque de perturbations de déplacement chimique dans les spectres HSQC 2D lors du titrage dans p27-KID (Suppl. Fig. 4). Ceci est très probablement dû au fait qu'ils n'ont pas les caractéristiques chimiques spécifiques incorporées dans les modèles de pharmacophore pour les deux groupes de fragments.

Nous avons utilisé la molécule du groupe 2, SJ403 (Suppl. Tableau 1b), pour tester notre hypothèse selon laquelle les molécules qui se lient à p27 peuvent altérer sa fonction régulatrice de Cdk. Pour ces expériences, étant donné que SJ403 se lie faiblement à p27-KID, nous avons étudié sa capacité à moduler la liaison de p27-D2 à Cdk2/cycline A (valeur Kd se liant à Cdk2/cycline A, 73 ± 8 nM ; Fig. 4a versus 5 nM pour p27-KID20). Nous avons d'abord utilisé l'anisotropie de fluorescence (FA) pour surveiller le déplacement d'un mutant à cystéine unique (Cys) de p27-D2, avec l'arginine 93 mutée en Cys (R93C) et marquée avec Alexa Fluor 488 (p27-D2-FL), de Cdk2 /cycline A par SJ403. Le titrage de SJ403 a entraîné une réduction concentration-dépendante de la FA de p27-D2-FL, avec une valeur IC50 de 475 ± 67 μM (Fig. 4b), suggérant que SJ403 a déplacé p27-D2 de Cdk2 / cycline A.

Analyse d'anisotropie de fluorescence du déplacement de p27-D2-FL de Cdk2/cycline A par SJ403.

( a ) Analyse d'anisotropie de fluorescence de la liaison de Cdk2 / cycline A à p27-D2-FL. La condition de départ (20 nM p27-D2-FL, 300 nM Cdk2/cycline A) pour évaluer l'effet du fragment atteint SJ403 sur la fonction p27 est représentée par le cercle rouge sur l'isotherme de liaison. ( b ) Le titrage de SJ403 (0–3 mM) a provoqué le déplacement de p27-D2 de Cdk2 / cycline A, entraînant une diminution des valeurs d'anisotropie de fluorescence. Les expériences ont été réalisées en triple et en valeurs moyennes et les écarts-types des moyennes sont indiqués.

Nous avons ensuite utilisé la spectroscopie RMN pour surveiller le déplacement de p27-D2 marqué au 2H/13C/15N de Cdk2/cycline A par SJ403 ; le complexe de p27-D2 avec Cdk2/cycline A (100 µM) a été préparé avec un léger excès de 2H/13C/15N-p27-D2 (rapport molaire 1,1 : 1,0 p27-D2 : Cdk2/cycline A). Les pics de p27-D2 non lié ont considérablement augmenté en intensité en présence de SJ403, tandis que les résonances de p27-D2 lié à Cdk2 / cycline A ont été réduites en intensité (Fig. 5 et Suppl. Fig. 7a – c), ce qui correspond à une déplacement de p27-D2 de Cdk2/cycline A. Une méthode ratiométrique a été utilisée pour analyser les spectres RMN TROSY-HSQC 2D. Dans cette méthode, la population relative des résonances à l'état libre (pf; pour la résonance de chaque résidu p27-D2) a été déterminée comme une fraction de l'intensité totale des résonances libres et liées pour un résidu donné. Ces valeurs ont été comparées en formant le rapport des deux populations à l'état libre relatif (pfw/SJ403/pfw/o SJ403) ; les valeurs supérieures à 1 indiquent un déplacement dépendant du composé. Les populations relatives pour l'état lié (pb) ont également été déterminées pour les échantillons sans (pbw/o SJ403) et avec SJ403 (pbw/SJ403). Dans ce cas, des rapports inférieurs à 1 indiquaient un déplacement de p27-D2 de Cdk2/cycline A. En outre, les valeurs de déplacement chimique des résonances à l'état libre reflétaient la liaison de p27-D2 à SJ403 (Suppl. Fig. 7d,e), en outre supportant la conclusion que SJ403 déplace l'équilibre de liaison entre p27-D2 et Cdk2/cycline A pour augmenter la population de p27-D2 non lié par le biais d'interactions protéine:petite molécule.

Analyse RMN 2D 1H-15N TROSY-HSQC du déplacement de 15N-p27-D2 de Cdk2/cycline A par SJ403.

Les spectres RMN 2D 1H-15N TROSY-HSQC de p27-D2/Cdk2/cycline A en l'absence (témoin) et en présence de SJ403 (3 mM), respectivement, ont été enregistrés. Pour les résidus rapportés, des résonances p27-D2 libres et liées ont été observées dans les spectres TROSY-HSQC. Une augmentation de l'intensité relative des résonances p27-D2 libres a été observée dans le spectre TROSY-HSQC de p27-D2/Cdk2/cycline A en présence de SJ403, par rapport au spectre contrôle (a), tandis que les résonances de p27 -D2 lié à Cdk2/cycline A a montré une diminution de l'intensité relative (b). Ceci permet le calcul des populations de p27-D2 libre (f) et lié (b), en l'absence (sans SJ403) et en présence de SJ403 (avec SJ403)). Les valeurs pfw/o SJ403 représentent les populations relatives de résonances pour p27-D2 libre avant addition de SJ403 et les valeurs pfw/SJ403 sont les populations relatives de résonances p27-D2 à l'état libre après addition de SJ403. De même, les valeurs pbw/o SJ403 représentent les populations relatives de résonances pour p27-D2 lié à Cdk2/cycline A avant l'ajout de SJ403 et les valeurs pbw/SJ403 sont les populations relatives des résonances p27-D2 à l'état lié après l'ajout de SJ403. Les valeurs moyennes et les écarts types des moyennes pour les mesures en triple sont indiqués ; un ensemble de spectres 2D 1H-15N TROSY-HSQC en triple est illustré dans Suppl. Fig. 7.

Les résultats FA et RMN ont indiqué que SJ403 a partiellement déplacé p27-D2 de Cdk2/cycline A ; par conséquent, nous avons ensuite étudié si le déplacement modulait l'activité kinase de Cdk2. p27-D2, bien que dépourvu des sous-domaines D1 et LH trouvés dans p27-KID, est toujours un inhibiteur modérément puissant de Cdk2/cycline A (valeur IC50, 152 ± 39 nM; Suppl. Fig. 9a). Dans des conditions où Cdk2 / cycline A était presque complètement inhibée par p27-D2 (~ 13% de l'activité complète de la kinase était maintenue), le titrage de SJ403 sur la plage de concentration indiquée dans les expériences FA et RMN pour provoquer le déplacement de p27-D2 a conduit à une augmentation de la kinase activité (de 13% à ~ 20%, une augmentation> 50%; Fig. 6a et Suppl. Fig. 9b), compatible avec le déplacement partiel de p27-D2 de Cdk2 / cycline A par SJ403. De plus, en l'absence de p27-D2, SJ403 a considérablement inhibé l'activité Cdk2/cycline A à des concentrations qui, en présence de p27-D2, étaient associées au déplacement de p27-D2 et à une activité kinase accrue (Fig. 6b et Suppl. 9c) . Ainsi, nous concluons que l'effet principal de SJ403 est le déplacement de p27-D2 de Cdk2/cycline A (par la liaison de SJ403 à p27-D2) et la restauration partielle de l'activité kinase, même si un effet secondaire de SJ403 est d'inhiber la kinase activité (par la liaison de SJ403 à Cdk2/cycline A). Ces résultats fournissent une preuve de principe qu'une petite molécule (SJ403) inhibe la fonction d'une protéine désordonnée (p27-D2) par séquestration dans une conformation incapable de se lier et d'inhiber Cdk2/cycline A.

La petite molécule SJ403 déplace p27-D2 de Cdk2/cycline A et restaure partiellement l'activité de la kinase Cdk2.

Analyse de l'activité Cdk2 kinase [au sein du complexe Cdk2/cycline A (200 pM) en utilisant l'histone H1 comme substrat] en présence de p27-D2 (200 nM) et de concentrations variées de SJ403 (de 10 μM à 3 mM) (a ) et des concentrations variées de SJ403 seul (b). Cdk2 est partiellement actif dans les conditions de départ en (a) et l'activité est renforcée par l'ajout de SJ403. En l'absence de p27-D2 (b), l'ajout de SJ403 est associé à l'inhibition de Cdk2. Toutes les expériences ont été réalisées en triple et en valeurs moyennes et les écarts-types des moyennes sont indiqués.

Nous avons précédemment montré sur la base de données informatiques de RMN et de dynamique moléculaire (MD) que p27-KID présente différents types de structure secondaire partiellement peuplée à l'état libre, y compris une structure hélicoïdale dans le sous-domaine LH, une conformation en épingle à cheveux β dans la sous-région D2.1 et structure hélicoïdale dans la sous-région D2.3 du sous-domaine D2 (réf. 21 ; voir Fig. 1a pour la nomenclature sous-domaine/sous-région). Fait intéressant, les molécules des groupes 1 et 2 ont interagi de manière variable avec deux de ces régions partiellement structurées de p27-KID (sous-régions D2.1 et D2.3), mais aussi avec la sous-région D2.2, qui est très dynamique et ne ne pas présenter de structure secondaire persistante21 (Fig. 7a–c); ces sites d'interaction sont tous dans le sous-domaine D2 de liaison à Cdk2. Notamment, les molécules de liaison p27 n'ont pas interagi avec les sous-domaines D1 ou LH. Il est important de noter que chacune des régions de p27-KID qui interagissait avec de petites molécules contenait plusieurs acides aminés aromatiques (Fig. 7a). En fait, le sous-domaine D2 contient huit des neuf acides aminés aromatiques trouvés dans p27 ; un neuvième, F33, se trouve dans le sous-domaine D1 mais s'est lié à de petites molécules. Les molécules du groupe 1 ont causé les plus grands CSP pour les résidus F87, Y88 et Y89 dans la sous-région D2.3 et les molécules du groupe 2 ont perturbé les résonances pour ces résidus ainsi que pour les résidus W60, N61 (sous-région D2.1) et E75, W76 et Q77 (sous-région D2.2). Les résidus de phénylalanine (F) ou de tyrosine (Y) flanquent les résidus de tryptophane (W), mais présentaient des valeurs de CSP plus faibles en présence de composés du groupe 2 que les résidus W, suggérant que les petites molécules perturbaient préférentiellement l'environnement électronique des anneaux d'indole de ces résidus. Nous avons testé cette hypothèse par mutagenèse de W60 ou W76, ou des deux, dans p27-KID en F ou en alanine (A) et utilisé la RMN 2D pour cartographier la liaison à SJ403. Les variants p27-KID à mutation unique présentaient des modèles de CSP similaires à ceux observés pour le p27-KID de type sauvage, sauf que les perturbations à proximité des résidus W mutés étaient absentes (Suppl. Fig. 5a, b, d, e). Cependant, les deux variants p27-KID doublement mutés ne présentaient que des CSP très faibles dans le cluster aromatique F87YY89 (Suppl. Fig. 5c, f). Ensemble, ces résultats indiquaient que chacun des deux résidus W, W60 et W76, contribuait substantiellement à la liaison à SJ403. Les mutations de F87, Y88 ou Y89 en A étaient associées à des CSP considérablement réduits dans la région de liaison du composé du groupe 1 de p27-KID (Suppl. Fig. 5j – l), tandis que la mutation de R90 en A (Suppl. Fig. 5m) avait peu d'effet sur la liaison, ce qui implique que le regroupement des chaînes latérales aromatiques est essentiel à l'interaction petite molécule:protéine. Avec le mutant Y88 à A p27-KID, le composé du groupe 2, SJ403, a provoqué des CSP près des deux résidus W (W60 ou W76) mais pas dans la région F87A88Y89 de p27-KID (Suppl. Fig. 5h). Cependant, avec les mutants F87 à A et Y89 à A, SJ403 a provoqué des modèles de CSP similaires à ceux observés avec p27-KID de type sauvage (Suppl. Fig. 5g, i), suggérant que Y88 contribue dans une plus grande mesure aux interactions avec SJ403. (et éventuellement d'autres composés du groupe 2) que Y89.

Les petites molécules se lient à des amas de résidus aromatiques avec le sous-domaine D2 de p27-KID.

( a ) La séquence d'acides aminés de p27-D2 montrant le sous-domaine D2 et les régions de liaison individuelles des petites molécules (marquées D2.1, D2.2 et D2.3). Les acides aminés aromatiques dans ces régions sont illustrés en gras. Ceux-ci représentent huit des neuf résidus aromatiques dans p27-KID. ( b, c ) Valeurs moyennes de perturbation du déplacement chimique 1H pour tous les composés du groupe 1 ( b ) et du groupe 2 ( c ) illustrant les préférences pour les interactions avec les résidus Y ( b ) et W et Y ( c ), respectivement.

Les deux résidus W et Y88 de p27 sont conservés dans la protéine régulatrice du cycle cellulaire désordonné apparentée, p21Waf1/Cip1 42 (p21 ; Fig. 8a), ce qui permet de tester davantage leur dominance dans les interactions avec les composés des groupes 1 et 2 (Fig. 8b ,c). Le composé du groupe 2, SJ403, a interagi avec les résidus proches de W49 et W65 de p21 (dans le domaine inhibiteur de la kinase p21, p21-KID) mais pas avec Y77 (homologue à Y88 de p27 ; Fig. 8c), confirmant l'importance des résidus W pour les interactions avec cette petite molécule, mais suggérant également que le regroupement d'au moins deux résidus Y et F est nécessaire pour des interactions supplémentaires. Les deux résidus de leucine (L) flanquant Y77 dans p21 (L76 et L78) ne remplacent pas F87 et Y89 dans p27. De même, la région L76YL78 de p21 ne supporte pas la liaison à un composé du groupe 1 (SJ319843 ; figure 8b). Ces découvertes avec p21-KID renforcent encore notre explication de la base moléculaire des interactions des composés des groupes 1 et 2 avec p27.

Interaction de p21-KID avec des fragments représentatifs de p27.

(a) Comparaison des séquences d'acides aminés des sous-domaines D2 de p27-KID et p21-KID ; ( b, c ) Perturbations individuelles du déplacement chimique 1H (ΔδHN) (par analyse des spectres RMN HSQC 2D 1H-15N) causées par l'ajout de SJ319843 (b, groupe 1) et SJ403 (c, groupe 2), respectivement, à 2H / 15N-p21-KID (20 μM). Le seuil d'identification des interactions de liaison spécifiques avec les résidus p27-KID a été défini comme deux écarts-types au-dessus de la moyenne des perturbations de déplacement chimique (Δδave + 2σ, représenté par la ligne noire pointillée) et considéré si les perturbations étaient plus grandes que la résolution numérique expérimentale 1H (représenté par une ligne pointillée magenta).

Pour mieux comprendre les caractéristiques structurelles des sites de liaison des petites molécules au sein de p27, nous avons effectué des simulations de dynamique moléculaire (MD) (sur 400 ns) avec p27-D2. Les résultats ont récapitulé les découvertes antérieures de MD (plus de 100 ns) pour la construction p27-KID plus longue21 qui a révélé une épingle à cheveux β transitoire impliquant les résidus W60-F64 et H67-L70 (dans la sous-région D2.1) et deux tours α-hélicoïdaux impliquant résidus E80-G82 et F87-Y89 (dans la sous-région D2.3). Dans la nouvelle trajectoire MD, ces structures secondaires étaient stables sur de courtes échelles de temps en nanosecondes, mais se dépliaient et se repliaient sur les périodes de temps plus longues échantillonnées dans cette expérience. Ces transitions à plus longue échelle de temps ont été couplées à la formation transitoire de clusters hydrophobes impliquant des résidus dans les sous-régions D2.1 et 2.2 (contenant W60 et W76) et la sous-région D2.3 (contenant Y88 ; Fig. 9a) qui a donné lieu à conformations étendues et compactes (marquées E et C sur la Fig. 9b). Des conformateurs étendus et compacts représentatifs sont présentés sur les Fig. 9c et d, respectivement et tous les autres dans Suppl. Fig. 10a,b. (Notez que les conformères sont définis comme compacts si deux des trois résidus aromatiques de p27 critiques pour la liaison aux petites molécules, W60, W76 et Y88, sont à moins de 20 Å l'un de l'autre.) Nous supposons que les conformations étendues et compactes créent une liaison sites pour les composés du groupe 1 et du groupe 2, respectivement. Notre interprétation de ces résultats est que les composés du groupe 1 se lient au motif F87YY89 dans la sous-région D2.3 dans les molécules p27-D2 dans lesquelles Y88 est éloigné de W60 et W76 (> 20 Å) et que les molécules du groupe 2 se lient au compact conformations lorsqu'au moins deux des trois résidus aromatiques critiques dans les différentes sous-régions (sous-domaines D2.1, D2.2 et D2.3) sont regroupés. Fait intéressant, l'analyse de la trajectoire MD a montré que Y88 et W60 ou W76 étaient fréquemment en contact étroit, mais que les trois résidus étaient rarement à proximité (Suppl. Fig. 10c). Cela suggère qu'il existe plusieurs conformations différentes avec des résidus aromatiques groupés (en particulier, Y88 et W60 ou W76) capables de se lier aux composés du groupe 2, conformément aux résultats de mutagenèse montrant que W60 ou W76, mais pas les deux, sont indispensables pour le groupe 2 liaison composée (Suppl. Fig. 5a–f). En résumé, les nouveaux résultats MD pour p27-D2 suggèrent fortement que les fluctuations conformationnelles transitoires qui créent et perturbent les amas de résidus aromatiques modulent la liaison des petites molécules du groupe 1 et du groupe 2 à p27-D2. Ces résultats sont cohérents avec l'identification de W60, W76 et Y88 par RMN en tant que sites principaux pour la liaison du composé et avec les résultats montrant que la liaison est altérée par mutation de ces résidus.

Les profils de distance des atomes Cβ W60, W76 et Y88 suivis en fonction du temps à partir de simulations MD révèlent des états étendus et compacts dans l'ensemble conformationnel p27-D2.

(a) Distance entre les atomes Cβ W60-W76 (gauche), W60-Y88 (centre) et W76-Y88 (droite) suivis dans le temps depuis MD avec des lignes grises représentant la distance instantanée (toutes les 2 ps) et des lignes rouges représentant le temps moyenne (chaque ns). Les moments auxquels les conformères représentatifs étendus (E) et compacts (C) ont été extraits pour être affichés dans Suppl. Fig. 10 sont indiqués. (b) Illustration des distributions des distances en (a) sous forme d'histogrammes (lignes rouges). Les distributions montrent l'existence de deux états distincts pour W60-Y88 (au centre) et W76-Y88 (à droite) indiquant des conformations compactes (C) et étendues (E) (voir Suppl. Fig. 10). ( c, d ) Conformations représentatives étendues ( c ) et compactes ( d ), respectivement, montrant les positions relatives des résidus de p27-D2 impliqués dans l'interaction avec les fragments frappés.

La découverte de médicaments contre les protéines repliées implique souvent l'identification de composés qui se lient à des sites qui sont naturellement utilisés pour des interactions avec de petites molécules ou des ligands macromoléculaires. Ces types de sites de liaison sont stables dans le temps et permettent des interactions spécifiques et étroites avec de petites molécules chimiquement complémentaires. En revanche, les protéines désordonnées (ou régions protéiques désordonnées) présentent des conformations dynamiques et hétérogènes qui ne présentent pas de sites de liaison de petites molécules similaires et stables dans le temps. Cependant, malgré l'absence de caractéristique stable dans le temps, de nombreuses protéines/régions désordonnées interagissent avec des partenaires macromoléculaires par le processus de repliement lors de la liaison. Nous avons émis l'hypothèse que la capacité d'une protéine désordonnée à se lier à d'autres protéines conférerait également la capacité de se lier à de petites molécules et testé cette idée à travers les études de p27 décrites ici.

La protéine p27 entière est désordonnée et son domaine N-terminal (p27-KID) devient ordonné lors de la liaison à Cdk2/cycline A. Un court motif linéaire dans le sous-domaine D1 de p27-KID (avec la séquence R30NLFG34 ; L, Leucine Supplément Fig. Le sous-domaine D2 de p27 (p27-D2; 34 acides aminés de long) adopte une structure secondaire étendue et crée des interactions hydrophobes étendues avec Cdk2 lors de la liaison (Suppl. Fig. 11a, c et d). De plus, de nombreuses liaisons hydrogène se forment entre les résidus du sous-domaine D2 et Cdk2. Alors que p27-D2 présente 11 résidus hydrophobes et aromatiques (y compris les résidus I, L, V, F, W et Y), dont beaucoup contribuent aux interactions avec Cdk2, ce sous-domaine ne forme pas indépendamment un noyau hydrophobe stable.

Malgré un désordre étendu à l'état non lié, nous avons identifié deux groupes de petites molécules qui se lient avec une spécificité exquise bien qu'avec une faible affinité pour deux régions qui se chevauchent au sein de p27. Ces molécules se sont liées à des régions contenant des cycles aromatiques, avec une préférence pour les résidus W et Y. Les molécules du groupe 1 se sont liées à une région localisée, F87YY89, tandis que les molécules du groupe 2 se sont liées à cette région ainsi qu'à deux autres contenant deux résidus W (W60 et W76). De manière frappante, les molécules des groupes 1 (25 molécules) et 2 (14 molécules), respectivement, étaient chimiquement similaires, démontrant des relations d'activité de liaison à la structure chimique pour ces deux types de petites molécules : les interactions protéiques. Nous appelons ce phénomène des "relations structure-activité floues (SAR)" en raison du caractère "flou" des cartes de potentiel d'interaction respectives (Fig. 3a, b).

Ces caractéristiques chimiques des molécules de liaison de p27 peuvent être rationalisées sur la base des caractéristiques des résidus à l'intérieur et flanquant les sites de liaison identifiés par RMN dans p27-D2. Les molécules des groupes 1 et 2 présentaient deux ou trois cycles aromatiques hétérocycliques et présentaient le potentiel pour ces cycles de participer à des interactions hydrophobes (Fig. 3a, b; polygones d'or). Les molécules des deux groupes ont également montré le potentiel de lier des fractions électropositives (Fig. 3a, b; polygones cyan), ce qui correspond à la région F87YY89 dans les sites de liaison du groupe 1/2 flanquée à l'extrémité C-terminale par R90PPR93 et W60 dans le Le site de liaison du groupe 2 est flanqué à l'extrémité N-terminale par R58K59. Le résidu W76 dans le site de liaison du groupe 2 est flanqué d'acides aminés avec des caractéristiques à la fois électronégatives et électropositives, ainsi que polaires (E71GKYEW76QEVEK81), bien que le potentiel d'interactions avec les fractions électronégatives ne soit que faiblement représenté (Fig. 3b; polygones rouges). En plus des caractéristiques électrostatiques, les petites molécules, qui présentent des donneurs et des accepteurs de liaisons hydrogène, peuvent atteindre une spécificité grâce à des liaisons hydrogène transitoires avec des groupes complémentaires au sein de p27-D2, comme observé pour les petites molécules se liant à Myc44. Nous soutenons que ces caractéristiques et d'autres caractéristiques actuellement non appréciées de la chaîne polypeptidique p27-D2 créent le potentiel de se lier spécifiquement aux petites molécules des groupes 1 et 2.

Quelles sont les caractéristiques conformationnelles des sites de liaison des petites molécules au sein de p27 ? Nos calculs MD avec p27-D2 ont révélé des fluctuations dynamiques des distances par paires entre les résidus aromatiques (en particulier, W60, W76 et Y88) au sein des sites de liaison du groupe 2 (Fig. 9). Alors que W60 et W76 ont échantillonné une plage de distances relativement étroite (16,5 ± 2,3 Å), les distances entre W60 et Y88 et W76 et Y88 ont fluctué sur une plage plus large (20,5 ± 5,5 Å et 19,6 ± 4 Å, respectivement). De plus, ces dernières distances de paires de résidus présentaient chacune deux populations discrètes que nous appelons compactes (C) et étendues (E; Fig. 9b, panneaux du milieu et de droite). Nous proposons que les conformations compactes créent des sites de liaison pour les composés du groupe 2, conformément aux modèles RMN CSP (Fig. 7c). De plus, nous proposons que les conformations étendues favorisent la liaison des composés du groupe 1 à la région F87YY89, également cohérente avec les modèles RMN CSP (Fig. 7b). W60 est flanqué de F62 et F64 et W76 de Y74, mais les résultats de la mutagenèse (Suppl. Fig. 5a – f) suggèrent que les résidus W sont les principaux déterminants de la liaison des composés du groupe 2. Ceci est probablement dû au potentiel des chaînes latérales des résidus W et Y (mais pas des résidus F) à former des liaisons hydrogène avec de petites molécules, en plus de participer aux interactions hydrophobes et π-empilement. Fait intéressant, l'analyse de corrélation de distance (Suppl. Fig. 10c) a indiqué que, dans les conformations compactes, Y88 est le plus souvent proche de W60 ou W76 mais rarement proche des deux résidus W. Cela suggérait qu'une proximité étroite de Y88 et de l'un ou l'autre des deux résidus W créait des sites de liaison dans p27-D2 pour les composés du groupe 2. Cette observation est également cohérente avec les résultats de mutagenèse, qui ont montré que la mutation des deux résidus W, mais pas des résidus W individuels, a abrogé la liaison aux composés du groupe 2 (Suppl. Fig. 5c, f contre a, b, d, e). En résumé, p27-D2 a présenté des contacts étroits transitoires entre W60 ou W76 et Y88, ce qui, selon nous, crée des sites de liaison pour les composés du groupe 2. De plus, lorsque ni le résidu W ni Y88 ne sont proches, la proximité spatiale des trois résidus aromatiques dans la région F87YY89 a créé des sites de liaison pour les composés du groupe 1. Il est intéressant de noter que, dans la structure liée à Cdk2/cycline A de p27-KID34, les cinq résidus aromatiques dans les sous-régions D2.1 et D2.2 (qui se lient aux composés du groupe 2) sont très proches (mais séparés de la région F87YY89 ; Suppl. Fig. lia, c et d). Les résultats MD montrent qu'en l'absence de Cdk2/cycline A, des sous-ensembles de ces huit résidus aromatiques interagissent de manière transitoire, créant parfois des sites de liaison pour différents types de petites molécules aromatiques hétérocycliques (groupe 1 ou 2).

Il a été démontré que le composé, SJ403, séquestre p27-D2 loin de Cdk2/cycline A et active l'activité catalytique de Cdk2, remplissant efficacement notre objectif d'inhiber la fonction inhibitrice du cycle cellulaire de p27. Bien que l'affinité des molécules des groupes 1 et 2 soit faible, elles présentent une spécificité élevée pour des régions particulières de p27. Comme discuté ci-dessus, les résidus dans ces régions engagent autrement Cdk2. Remarquablement, les > 2 300 composés qui ont été criblés n'ont pas réussi à se lier à d'autres régions de p27 (sous-domaines D1 et LH), ce qui suggère que ces autres régions manquent d'une densité suffisante de résidus aromatiques (en particulier, les résidus W et Y) pour reconnaître spécifiquement les petits hétérocycles. molécules aromatiques. Le sous-domaine LH, isolé, ne se lie pas à Cdk2/cycline A mais le sous-domaine D1 se lie à la cycline A avec une haute affinité (Kd, 42 nM)45. Nous supposons que le motif RxLFG dans cette dernière région, en raison de sa longueur limitée, ne peut pas adopter des conformations qui créent des poches de liaison pour les petites molécules, comme cela est possible pour le sous-domaine D2 beaucoup plus long. Cependant, la faible affinité des composés des groupes 1 et 2 pour p27 limite leur applicabilité à notre objectif plus large de moduler la fonction de p27 dans les cellules et, finalement, les humains. Comment augmenter l'affinité des petites molécules pour p27 ? Nous proposons que les molécules des groupes 1 et 2 provoquent un degré de restriction conformationnelle dans p27-D2 et que les molécules qui renforcent cette restriction présenteront une affinité plus élevée. Nous envisageons que les petites molécules avec une plus grande "tridimensionnalité", qui présentent des caractéristiques chimiquement diverses et complexes, seront de meilleurs modèles pour la liaison et la séquestration de p27. Des efforts basés sur deux stratégies sont en cours pour optimiser nos occurrences de fragments en utilisant la chimie de synthèse. Tout d'abord, nous "développons" les échafaudages des groupes 1 et 2 en introduisant diverses fractions chimiques à diverses positions sur les systèmes de noyaux hétérocycliques pour permettre des interactions supplémentaires avec des résidus proches de W60, W76 et Y88 dans p27-D2. Deuxièmement, lorsque les expériences de culture seront terminées, nous "lierons" synthétiquement les molécules optimales des groupes 1 et 2 pour améliorer encore la liaison à p27-D2. Les résultats de ces futures expériences indiqueront si les stratégies synthétiques d'optimisation des composés qui ont émergé de la découverte de médicaments basés sur la structure peuvent être appliquées à une protéine désordonnée. En conclusion, nous avons découvert de petites molécules avec un "SAR flou" qui médient la liaison spécifique et l'inhibition de p27, démontrant le potentiel de cibler rationnellement les protéines désordonnées à l'avenir.

Les constructions p27 ont été exprimées dans E. Coli avec une étiquette d'affinité N-terminale 6xHis après sous-clonage dans pET28a (Novagen) en utilisant des procédures établies20. Cela comprenait p27-KID (résidus 22-105 de p27 humain) et les mutants suivants : W60A, W60F, W76A, W76F, W60A-W76A, W60F-W76F, F87A, Y88A, Y89A et R90A. p27-D2 (résidus 58-105 de p27 humain) et le mutant, C99S-R93C, ont été exprimés de manière similaire. Les protéines marquées aux isotopes (15N, 13C/15N et 2H/13C/15N) ont été exprimées dans un milieu minimal à base de MOPS en utilisant des procédures établies22. Toutes les constructions p27 ont été purifiées par chromatographie d'affinité au nickel, digérées avec de la thrombine pour éliminer l'étiquette 6xHis et purifiées davantage par chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inverse à l'aide d'une colonne C4 (Vydac) et d'un solvant eau/acétonitrile contenant de l'acide trifluoroacétique à 0,1 %. système. Les concentrations de protéines ont été déterminées par absorbance UV à 280 nm en utilisant un coefficient d'extinction molaire de 15 470 M−1 cm−1 pour p27-KID, p27-KID-F87A, p27-KID-R90A, p27-D2 et p27-D2-C99S- R93C; 13980 M-1cm-1 pour p27-KID-Y88A et p27-KID-Y89A ; 9 970 M-1 cm-1 pour les variants p27-KID avec un seul résidu tryptophane ; et 4 470 M-1 cm-1 pour les variants de p27-KID sans résidu tryptophane. La Cdk2 humaine pleine longueur, la Cdk2 active (phosphorylée à la thréonine 160), la cycline A humaine tronquée (résidus 173–432) et le p21-KID ont été exprimés et purifiés à l'aide de protocoles établis20,46.

Le complexe Cdk2/cycline A a été préparé en équilibrant Cdk2 et cycline A (rapport molaire 1:1) pendant 1 heure à 4 °C, suivi d'une purification par chromatographie d'exclusion stérique (résine S75, GE Healthcare, Piscataway, NJ) dans un tampon contenant 20 Tris mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, TCEP 5 mM). Le complexe ternaire a été préparé en équilibrant 2H/13C/15N-p27-D2 avec Cdk2/cycline A (rapport molaire 1,1:1) à 4 °C pendant une nuit, suivi d'une purification par chromatographie d'exclusion stérique (résine S200, GE Healthcare, Piscataway, NJ ) dans le même tampon que le complexe Cdk2/cycline A. Pour les expériences de RMN, le complexe 2H/13C/15N-p27-D2/Cdk2/cycline A a été échangé avec du tampon dans du phosphate de Na 20 mM, pH 6,5, NaCl 200 mM, DTT-D10 10 mM et 10 % de 2H2O.

La bibliothèque de fragments utilisée pour cribler la liaison à p27-KID était composée de deux collections qui ont été conçues selon différents critères : (a) 1 100 fragments ont été achetés auprès de la Maybridge Ro3 Diversity Fragment Library (« Maybridge »)47 et (b) 1 222 les fragments ont été achetés auprès d'Enamine (N = 250) et de Life Chemicals (N = 972) à l'aide d'un algorithme interne ("In-House").

La collection de fragments de Maybridge a été conçue pour fournir une large couverture de l'espace chimique pour la découverte de médicaments à base de fragments. Chaque fragment satisfait la règle des trois de Congreve40 : (a) poids moléculaire < 300 ; (b) nombre de donneurs de liaisons hydrogène ≤ 3; (c) nombre d'accepteurs de liaisons hydrogène ≤ 3; et (d) clogP ≤ 3. Tous les composés ont une solubilité à l'équilibre déterminée expérimentalement ≥ 200 mM (DMSO) et ≥ 1 mM (PBS) et une pureté confirmée ≥ 95 % (sur la base d'une analyse par chromatographie liquide/spectrométrie de masse) et sont exempts de réactif ou des groupes fonctionnels toxiques. Les 1 100 fragments constituent un ensemble « de base » qui englobe la diversité chimique de l'ensemble de la collection (1 823 fragments).

La collection de fragments internes se compose de 1 222 composés disponibles dans le commerce sélectionnés à l'aide d'un algorithme personnalisé conçu pour identifier des molécules structurellement complexes et de faible poids moléculaire avec des échafaudages qui ont été bien échantillonnés dans la bibliothèque de criblage à haut débit St. Jude distincte (bibliothèque HTS, >500 000 composés ; voir ci-dessous). Tout d'abord, les collections de fragments commerciaux (sous-ensembles de collections de diversité plus larges filtrées pour les caractéristiques "de type fragment") ont été filtrées pour éliminer les molécules contenant des atomes inorganiques, des isotopes ou des structures invalides et pour éliminer les molécules qui n'étaient pas disponibles en quantité suffisante (<50 mg) . Les molécules passantes ont été extraites des échafaudages de Murcko à l'aide de Pipeline Pilot (composant "Générer des fragments" dans Accelrys v. 8.5 avec des atomes alpha préservés, voir réf. 48 pour la méthode générale). Ces échafaudages ont ensuite été filtrés selon les règles suivantes : nombre de sous-structures réactives = 0 (filtres 'REOS'49,50,51, nombre de liaisons rotatives <= 3, nombre d'atomes lourds >= 10, nombre d'anneaux >= 1 et nombre de substitutions d'anneaux > 1 pour les systèmes à un seul anneau et nombre de molécules présentes dans la bibliothèque St. Jude HTS contenant l'échafaudage >= 8. Les molécules contenant ces échafaudages ont été identifiées dans les bibliothèques de fragments commerciaux, puis priorisées pour l'achat en fonction de la complexité Oprea la plus élevée52 Cette bibliothèque a les propriétés physico-chimiques moyennes calculées suivantes : MW = 246 ± 39 Da, nombre d'atomes = 17 ± 3, log P = 1,7 ± 1,0, surface polaire = 63 ± 19 Å2, nombre d'accepteurs de liaison H = 4,3 ± 1,4 et nombre de donneurs de liaison H = 1,3 ± 0, 9. Les distributions de ces caractéristiques chimiques et d'autres des deux bibliothèques de fragments sont résumées dans la figure 12a supplémentaire.

Les cartes de champ de consensus pour les molécules des groupes 1 et 2 ont été définies à l'aide du module FieldTemplater de Forge (v10, Cresset, REF = http://www.cresset-group.com/products/forge/accessedDec2014). Le module FieldTemplater prend en entrée un ensemble de molécules de référence (les composés actifs des groupes 1 et 2 identifiés lors des deux premiers cycles de criblage ; Suppl. Tableau 1A, B) et cherche à les aligner afin de maximiser le chevauchement entre leurs champs d'interaction . Les molécules de référence sont d'abord alignées à l'aide de points de champ, suivies d'une optimisation plus lente et plus précise de l'alignement à l'aide du champ d'interaction complet. Avant l'alignement, les conformations étaient générées à l'aide de l'option de recherche de conformation "Très précise et lente" dans Forge et les paramètres par défaut. La fonction de notation de similarité utilisée dans l'alignement était basée sur une similarité de champ de 100 % et une similarité de forme de 0 % afin de maximiser la diversité topologique des molécules récupérées à l'aide du modèle lors du prochain cycle de criblage.

Les cartes de champ consensuelles pour les molécules des groupes 1 et 2 ont été utilisées pour interroger une base de données de 10 455 molécules de type fragment de ChemDiv (www.chemdiv.com) à l'aide du module FIeldScreen dans Forge. Sur les 215 molécules avec les scores de similarité de champ les plus élevés, 184 composés ont été achetés. Cependant, 106 d'entre eux étaient peu solubles dans nos conditions de test et n'ont pas été testés. Parmi les 78 composés restants, 12 résultats supplémentaires ont été identifiés à l'aide de la RMN HSQC 2D 1H-15N (voir ci-dessous).

Des expériences de criblage et de validation RMN ont été réalisées à 298 K (25 °C) en utilisant soit un spectromètre Varian Inova 600 MHz équipé d'une sonde à gradient de température ambiante à triple résonance (HCN), soit un spectromètre Bruker Avance 600 MHz équipé d'une sonde à gradient cryogénique TCI et d'un Passeur d'échantillons SampleJet. Les molécules de fragment ont été initialement analysées sous forme de pools de cinq molécules dissoutes à 10 mM chacune dans du DMSO-D6. Les pools de fragments contenus dans des plaques 96 puits ont été mélangés à l'aide d'un manipulateur de liquide Gilson 215 avec un tampon (phosphate de Na 20 mM, pH 6,5, NaCl 20 mM, 2H2O 10 %, DTT-D10 5 mM) ou un tampon contenant la protéine p27-KID (10 μM p27-KID) pour donner des concentrations finales de composé de 200 μM chacune. Pour les expériences initiales de criblage de fragments, des spectres RMN 1H et WaterLOGSY35 unidimensionnels (1D) ont été enregistrés pour les pools de composés sans et avec protéine. Les pools présentant des résultats ont été déconvolués en analysant des composés purs à l'aide de 1D 1H et validés par des expériences de RMN hétéronucléaire bidimensionnelle (2D) (titrages HSQC 2D 1H-15N) à l'aide du spectromètre Bruker Avance 600 MHz. Les échantillons RMN utilisés pour les titrages HSQC 2D 1H-15N contenaient 100 μM de protéine p27 marquée au 15N (mutants p27-KID, p27-KID ou p27-D2) dans du phosphate de Na 20 mM, pH 6,5, NaCl 200 mM, 10 % 2H2O, DTT-D10 5 mM ; les composés dissous dans du DMSO-D6 ont été titrés aux concentrations souhaitées. Du DMSO-D6 a été ajouté pour maintenir une concentration constante (2 % vol/vol). Une résolution spectrale de 3,5 et 5,7 Hz a été obtenue dans les dimensions 1H et 15N, respectivement. Le tryptophane et la tyrosine, respectivement, ont été titrés en 15N-p27-KID (100 μM) jusqu'à 3 mM. Des expériences de triple résonance tridimensionnelle (3D) du squelette pour établir les attributions de résonance pour les constructions p27 ont été réalisées à l'aide du spectromètre Bruker Avance 600 MHz. Les affectations pour p27-KID et p27-D2 sont illustrées dans Suppl. Fig. 12b,c et d,e, respectivement. Des expériences de RMN 2D 1H-15N TROSY-HSQC avec 2H/13C/15N-p27-D2/Cdk2/cycline A et SJ403 ont été enregistrées à 308 K (35 °C). Des expériences HSQC 2D 1H-15N de fragments représentatifs (1 mM de SJ319843, groupe 1 et SJ403, groupe 2, respectivement) avec 15N-p21-KID (20 μM) ont été enregistrées à 298 K à l'aide d'un spectromètre Bruker Avance 600 MHz. Les spectres RMN ont été traités à l'aide du logiciel Bruker Topspin et analysés à l'aide du logiciel d'attribution de résonance assistée par ordinateur (CARA)53.

Les perturbations de déplacement chimique sont généralement quantifiées en tant que valeurs combinées de déplacement chimique 1H et 15N. Cependant, l'analyse des données primaires pour les petites molécules se liant à p27 a montré que les plus grands CSP concernaient la dimension 1H, qui étaient statistiquement significatives et que les valeurs correspondantes de CSP 15N étaient souvent petites et non significatives. Ainsi, l'utilisation de valeurs de déplacement chimique combinées masquerait les effets de la liaison du composé. Nous avons également rigoureusement considéré l'ampleur des CSP par rapport à la résolution numérique expérimentale des dimensions 1H et 15N des spectres HSQC et un seuil défini comme la valeur moyenne du CSP plus deux fois l'écart type de la moyenne (Δδave + 2σ). Ainsi, l'évaluation de la signification statistique était basée sur le fait qu'une valeur CSP particulière était supérieure à, i) la résolution spectrale expérimentale dans la dimension donnée (1H ou 15N) et ii) la quantité, Δδave + 2σ, pour cette dimension.

Seize titrages ponctuels de fragments représentatifs du groupe 1 et du groupe 2 (SJ572710 et SJ572403, respectivement) dans 15N-p27-KID (100 μM) ont été enregistrés à l'aide d'un HISQC 2D 1H-15N "en phase" adopté avec découplage des protons pendant 15N marquage par déplacement chimique réalisé avec une impulsion composite WALTZ16 d'une amplitude de 7,1 kHz54,55. Toutes les expériences ont été recueillies sur un spectromètre Bruker Avance 800 MHz équipé d'une sonde à gradient cryogénique TCI. Les rapports molaires suivants de 15N-p27-KID (100 μM) à l'inhibiteur ont été utilisés : 1:0, 1:0,1, 1:1,5, 1:3, 1:4,5, 1:6, 1:7,5, 1:9 , 1:10.5, 1:12, 1:15, 1:18, 1:21, 1:24, 1:27 et 1:30. Chaque spectre a été enregistré avec 256 (t1,max = 31,0 ms) et 1024 (t2,max = 106,5 ms) points complexes dans les dimensions 15N et 1H, respectivement, avec huit transitoires collectés par point. La résolution spectrale des dimensions 1H et 15N était de 2,4 et 1,7 Hz, respectivement. Les perturbations de déplacement chimique tout au long du titrage devaient être supérieures à ce seuil de résolution pour être prises en compte pour une analyse plus approfondie. Les données ont été traitées à l'aide du package NMRPipe56 et analysées à l'aide de scripts internes écrits en Python à l'aide des bibliothèques informatiques Scipy et Mathematica (Wolfram Research). Afin d'atténuer le biais humain dans la détermination de la position du pic, la fonction de sélection automatique des pics dans NMRpipe a été utilisée dans laquelle une fenêtre spectrale a été attribuée pour chaque résonance sur toute la trajectoire du titrage pour un déplacement chimique donné. L'erreur dans la position du pic pour une résonance donnée a été prise comme la largeur de ligne 15N ou 1HN divisée par le rapport signal sur bruit. Toutes les résonances qui présentaient des perturbations de déplacement chimique supérieures aux résolutions spectrales et Δδave + 2σ ont ensuite été regroupées et ajustées globalement pour leur différence de déplacement chimique maximale respective et une constante de dissociation globale (Kd). L'erreur dans les valeurs de Kd a été déterminée à l'aide d'une approche de Monte-Carlo dans laquelle une erreur de 10 % a été imposée sur la concentration de ligand et l'erreur dans la position du pic du déplacement chimique a été prise en compte.

Le mutant p27-D2-C99S-R93C a été conjugué avec Alexa Fluor488-C5-Maléimide (Life Technologies, p27-D2-FL) dans un tampon contenant 20 mM de phosphate de Na, pH 7,3, 20 mM de NaCl selon le protocole du fabricant. La protéine conjuguée a été davantage purifiée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inverse en utilisant une colonne C4 (Vydac) et un système de solvant eau/acétonitrile contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique. Les fractions HPLC lyophilisées ont été remises en suspension dans un tampon contenant 20 mM de phosphate de Na, pH 7, 200 mM de NaCl, 3,5 mM de TCEP. Les mesures d'anisotropie de fluorescence ont été effectuées à 25°C sur un spectrofluorimètre Horiba Fluorolog 3. En bref, p27-D2-FL (20 nM) a été mélangé avec Cdk2/Cycline A (300 nM) et ajouté à la quantité requise de composé lyophilisé (SJ403). Tous les échantillons ont été incubés pendant une nuit dans l'obscurité à 4 ° C avant les mesures de fluorescence. Les données de liaison d'anisotropie de fluorescence ont été analysées à l'aide de KaleidaGraph. L'ajustement de la courbe a été effectué sur la moyenne de trois expériences indépendantes par un modèle de liaison de régression non linéaire.

Cdk2 / Cycline A (200 pM) a été mélangé avec Histone H1 (15 μM; EMD Millipore), p27-D2 (200 nM) et des quantités variables de SJ403 lyophilisé et incubé pendant une nuit à 4 ° C. L'effet du composé SJ403 sur l'activité de Cdk2 a été déterminé en réalisant des expériences similaires en l'absence de p27-D2. Par la suite, de l'ATP (concentration totale de 50 μM, dont 6 μCi γ 32P-ATP (PerkinElmer, Inc)) a été ajouté à chaque réaction et incubé pendant 35 minutes à 30 °C. Chaque réaction avait un volume total de 20 μL. Le tampon d'échantillon contenait 20 mM d'HEPES pH 7,3, 25 mM de β-glycérolphosphate de sodium, 15 mM de MgCl2, 16 mM d'EGTA, 0,5 mM de Na3VO4 et 10 mM de DTT. Les réactions ont été stoppées par addition de tampon de charge SDS-gel (5 μL) puis analysées par SDS-PAGE (10 μL). Les gels ont été séchés à 70 ° C sous vide et un phosphoimageur (GE Healthcare, Piscataway, NJ) a été utilisé pour quantifier les bandes 32P-Histone H1. Les valeurs IC50 ont été déterminées par ajustement de courbe à l'aide du logiciel KaleidaGraph. Les expériences ont été réalisées en triple et moyenne IC50 et les écarts types des valeurs moyennes sont rapportés.

Des simulations MD de tous les atomes à l'aide du logiciel AMBER 12 optimisé pour l'unité de traitement graphique (GPU)57 ont été utilisées pour explorer le paysage conformationnel du domaine p27-D2. La conformation de p27-D2 dans la structure p27-KID/Cdk2/cycline A (PDB ID, 1JSU) a été utilisée comme structure de départ à partir des calculs MD avec des états de protonation des acides aminés modifiés pour refléter un pH de 7,0. La structure a été placée dans une boîte rectangulaire d'eau TIP3P qui était de 15 Å plus grande de tous les côtés que la molécule p27-D2. En plus de neutraliser le système en ajoutant des contre-ions, du NaCl 20 mM a été ajouté pour imiter les conditions expérimentales dans nos simulations.

Le système a été équilibré et stabilisé en utilisant une minimisation d'énergie en plusieurs étapes à 298 K, comme décrit précédemment58. Tous les cycles de production ont été effectués en utilisant l'ensemble nombre constant de particules, volume et énergie (NVE) avec des conditions aux limites périodiques. La méthode d'Ewald à mailles de particules (PME) a été utilisée pour les interactions électrostatiques et une coupure de 10 Å a été utilisée pour les interactions de Lennard-Jones. L'algorithme SHAKE a été utilisé pour restreindre les mouvements de tous les atomes d'hydrogène liés par covalence. Les simulations ont été réalisées à 298 K et 1 atm de pression. L'échelle de temps totale pour notre simulation était de 0,4 microseconde avec des instantanés stockés toutes les 2 ps, ce qui donne un total de 200 000 instantanés de la trajectoire.

Comment citer cet article : Iconaru, LI et al. Découverte de petites molécules qui inhibent la protéine désordonnée, p27Kip1. Sci. Rep. 5, 15686; doi : 10.1038/srep15686 (2015).

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Les auteurs remercient Christy R. Grace pour son aide dans les expériences de RMN, Heather Ross pour la gestion de la bibliothèque composée et Ariele Viacava Follis pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health (NIH) des États-Unis R01CA082491 et 1R01GM083159 (à RWK), 2R01DC006471 et 1R21DC013879-01 (à JZ), Office of Naval Research Grants N000140911014, N000141210191 et N000141210 775 (à JZ), un ressortissant américain Cancer Institute Cancer Center Support Grant P30CA21765 (au St. Jude Children's Research Hospital) et ALSAC. LII a reçu la bourse de la Fondation Garwood du St. Jude Children's Research Hospital. DB tient à remercier l'US National Institute of General Medical Science (F32GM113290) pour son soutien.

Kavitha Bharatham

Adresse actuelle : Center for Chemical Biology and Therapeutics, Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, GKVK, Bellary Road, Bangalore, 560065, Inde

Département de biologie structurale, Memphis, TN, 38105

Luigi I. Iconaru, David Ban, Weixing Zhang et Richard W. Kriwacki

Département de neurobiologie du développement, Memphis, TN, 38105

Luigi I. Iconaru & Jian Zuo

Département de biologie chimique et thérapeutique, Hôpital de recherche pour enfants St. Jude, Memphis, TN, 38105

Kavitha Bharatham et Anang A. Shelat

Division des sciences et de l'ingénierie informatiques, Institut des sciences de la santé, Laboratoire national d'Oak Ridge, Oak Ridge, TN, 37830

Arvind Ramanathan

Département de microbiologie, d'immunologie et de biochimie, Centre des sciences de la santé de l'Université du Tennessee, Memphis, TN, 38163

Richard W. Kriwacki

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Recherche conçue par LII, DB, AR, WZ, AS, JZ et RWK ; LII, DB, KB et AR ont réalisé des expériences ; Données analysées par LII, DB, KB, AR, AS et RWK ; et LII, DB, AR, AS, JZ et RWK ont rédigé le manuscrit.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

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Réimpressions et autorisations

Iconaru, L., Ban, D., Bharatham, K. et al. Découverte de petites molécules qui inhibent la protéine désordonnée, p27Kip1. Sci Rep 5, 15686 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15686

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Reçu : 14 juillet 2015

Accepté : 25 septembre 2015

Publié: 28 octobre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep15686

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